Ⅲ. 원균관리 및 종균 접종 실습

충남농업기술원 생물환경과

농학박사 김 홍 규 

☎ 041- 330- 6301

1. 버섯 균주의 보존

가. 배지 제조

나. 원균이식

다. 균의 순수분리

라. 균주의 보존

2. 버섯 종균의 관리

가. 우량종균의 구비조건 

나. 종균검사방법

다. 종균진단 요령

라. 종균의 저장 및 관리

3. 종균의 퇴화 방지 

가. 종균의 퇴화원인

나. 종균의 퇴화방지

다. 우량종균 생산을 위한 제안

Ⅶ. 원균관리 및 종균접종 기술

충남농업기술원 생물환경과

농학박사 김 홍 규 

1. 버섯 균주의 보존

가. 배지 제조

(1) 감자를 씻은 후 껍질을 벗긴다. 감자 눈을 잘 도려내고 대략 사방 1㎝로 잘라서 200g 준비한다. 증류수 1L에 준비한 감자 조각 200g을 넣고 약한 불에서 약 30분간 끓여서 감자 전분을 추출한다.

(2) 가아제를 2～3매 겹쳐서 여과하든지 또는 (1)번의 액이 식을 때까지 정치한 후 가라앉은 찌꺼기가 들어가지 않도록 서서히 별도 용기에 부어서 사용할 수 있다. 여과된 액이 1L 가 되도록 증류수를 보충하여 채우고 설탕과 한천 20g를 넣는다.

(3) 호일로 싼 유리병은 살균 솥에 넣어 1.2kg/㎠의 압력에서 살균 솥 내부 온도가 121℃에 도달한 후로부터 15～20분간 살균한다. 65～70℃로 식은 감자 한천액은 무균상(클린벤치)에서 분주한다. 무균상은 작업 전에 반드시 알콜이나 자외선 살균등(UV등)으로 소독해야 한다. 작업 시에는 자외선 살균등을 끄고 형광등을 켜며, 에어 커튼을 동작시킨 후, 멸균된 샤레에 감자 한천액을 30～35㎖씩 분주한다.

(4) 감자 한천액 분주시 샬레를 겹쳐 두고 아래서부터 차례로 뚜껑을 가능한 한 조금만 열어서 신속히 부음으로써 오염 가능성을 최소화한다. 샤레를 겹쳐 놓음으로써 감자 한천액의 온기로 샬레의 뚜

껑에 맺히는 것을 줄일 수 있다. 한천은 약 45℃ 정도에서 굳는 성질이 있다. 젤라틴(젤리)처럼 굳으면 원균 증식용 배지로 사용한다.

나. 원균이식

(1) 접종할 원균의 오염여부와 균사활력을 점검한다. 신선하고 활력이 좋은 원균을 선발하여 사용한다. 원균을 이식하기 전, 백금구를 발갛게 달아오를 때까지 화염 소독한다. 

(2) 원균 시험관을 한 손으로 잡고 다른 손으로는 백금구를 가볍게 쥔 다음 새끼 손가락으로 원균 시험관의 마개 부분을 알콜 램

프 앞에서 살살 돌려 소독한 다음 마개를 가볍게 뽑는다. 백금구를 균사가 없는 한천 조각에 살짝 대어서 식히고 2×2㎜ 크기의 균사체를 한천배지와 함께 떼어낸다. 시험관을 들고 있는 손으로 샬레의 뚜껑을 비스듬히 열고 준비해둔 원균 증식용 감자한천 배지에 이식하고 뚜껑을 닫는다. 측면을 랩으로 두른 후 뒤집어서 품종 또는 균주번호, 접종자, 접종일 등을 기록한다

다. 균의 순수분리

버섯의 조직 내부는 잡균 오염부가 적기 때문에 자실체 조직에서 분리된 유전적으로 순수한 균주를 얻는데 유리하다. 대부분의 버섯은 조직분리가 가능하나 인공적인 배지에 균사증식이 어려운 것도 있어 분리할 수 없는 것도 있다.

(1) 자실체는 어리고, 신선하며, 청결한 것을 채집한다. 비오는 날 채집한 것과 수분이 많은 것은 실패하는 경우가 많다.

(2) 시험관의 사면 한천배지를 준비한다.

(3) 자실체에는 부착한 먼지 등을 제거하고 무균상 (clean bench) 내에서 갓의 정단표면을 화염멸균한 다음 면도날 또는 

커터로 찢어 2개로 나눈다(a). 갓의 표면에 점질물을 분비하는 것은 가제 등으로 닦아 제거한다. 또 대형이며 단단한 균류는 2～3㎝ 정도로 잘라도 좋다.

(4) 갓 또는 대의 단면을 멸균한 커터나 안과용 메스로 우선 종으로 2～3㎝ 간격으로 잘라 넣고 또 횡으로 몇 개 잘라 넣는다(b, c).

(5) 작게 잘라진 조직을 집어서(d) 사면배지 표면에 밀착하도록 접종한다(e). 1개의 재료에서 5～10본의 시험관에 분리한다.

(6) 균사배양적온에서 배양한다(f).

(7) 조직에서 분리한 균사가 자라면 잡균오염이 없는 것을 선택하여 새로운 한천배지에 재 분리한다(g). 그 조작은 2～3회 반복하는 것이 안전하다.

(8) 균주명, 채집지, 채집 년월일, 채집자, 균주 번호, 접종일을 기입한 라벨을 시험관에 붙이고 저온 보존법에 의해 보존한다.

(9) 분리용배지는 YMG배지, 감자 포도당배지, 에비오제 한천 배지 등 천연배지를 사용한다. 잡균오염 방지를 위해 테트라사이클린과 클로람페니클 항생물질 및(Thiabendzole) MBC(Methy- 2- benzimidajol) 등의 항곰팡이제 배지에 첨가한다.

(10) 팽이버섯 등 자실체가 작은 종류는 갓부분에서 조직을 떼어내기가 어렵기 때문에, 핀셋으로 갓하부를 집어 갓을 제거하고, 잘린 부분의 위로 돌출하는 대의 내부조직을 핀셋이나 백금선으로 떼어낸 다음 사면 배지에 분리한다. 복균류는 어린 균덩어리에서 조직을 채취한다.

버섯 조직분리방법

라. 균주의 보존

버섯균은 조직분리, 포자분리 그리고 균 간의 교배~육종 등을 통하여 얻을 수 있다. 이와 같이 얻어진 순수한 균주는 시간이 지남에 따라 자실체의 형질이나 생리적 특성 등이 퇴화되므로 이를 방지하기 위하여 균주의 특성이나 성질에 따라 여러 가지 방법으로 보

존을 한다. 

(1) 계대보존법

한천배지를 써서 균주를 일정기간 보존하는 방법으로 시험관에 사면 배양한 후 보통 저온(4～6℃)에서 보존하는데, 사면 부분을 완만히 하여 보존하는 경우와 사면 부분을 좁게 하여 보존하는 경우가 많으며 가끔 평면배양을 하기도 한다. 평면배양의 경우 직경 20～30㎜의 시험관이 적당하다. 샬레나 삼각플라스크에서는 자실체나 분생자가 형성되거나 잡균에 의해 오염되기 쉬운 반면, 시험관에서는 배지의 건조가 지연되어 장기간의 보존이 가능하며 잡균에 의한 오염이 적은 면전, 종이마개, 실리콘마개, 고무마개 등을 쓴다. 보존시 상대습도는 곰팡이 오염을 막기 위해 상대습도(R.H.)를 60% 이하로 유지한다. 보존기간은 보존온도에 따라 다르다. 8～15℃, 상대습도 60％ 정도에서 면전으로는 3～6개월, 실리콘마개로는 5～12개월까지 보존할 수 있으므로 그 기간 내에 정기적으로 이식하여 계대 보존할 필요가 있다. 

그러나 굵은 시험관에 실리콘마개를 하고 알루미늄 호일로 밀폐하였을 경우 2년 정도 그대로 보존되는 버섯류가 많다. 균주를 이식할 경우에는 가급적 사면 상단부 혹은 콜로니 주변부에 있는 어린 균사체와 배지를 소량 접종한다. 팽이, 맛버섯 등 분생자를 형성하기 쉬운 균주를 이식할 때에는 가급적 분생자가 접종원에 들어가지 않도록 주의하고 균사 부분을 약간 크게 절취하여 이식하는 것이 바람직하다. 보존중에는 광이 유해하다고는 할 수 없으나 광선에 의해 자실체의 형성이 촉진되는 버섯 균주가 많고, 자실체가 형성되어 담자포자가 만들어지면 유전적 성질이 변화될 수 있으므로 필요없는 조명은 하지 않는 것이 좋다. 균사체를 보존할 때, 보존실 내부는 

늘 청결을 유지하고 신선한 공기가 약간 유통되게 해야 한다. 어떤 종류의 버섯이라도 계대배양으로 장기보존 하는 것은 바람직하지 않다.

시험관을 이용한 계대배양 보존법

프랑스 아미셀의 균주보관

(2) 유동 파라핀 봉입법

시험관 내에 균사를 배양한 다음 그 위에 유동 파라핀을 넣어 배지가 건조되는 것을 방지하고 산소 공급을 차단하여 호흡을 최대한으로 억제시켜 대사속도를 지연되게 하여 장기 보존하는 방법이다. 유동 파라핀 대신에 멸균 증류수를 넣거나 멸균 증류수에 배양한 균사체를 침적하여 보존하는 방법도 있다. 

균이 배양된 시험관에 비중이 0.8～0.9인 백색 유동 파라핀을 121℃에서 60～120분간 증기 멸균한 다음 110～170℃에서 1～2시간 건조하여 수분을 증발시킨 후 냉각하여 준비된 시험관에 넣는다. 시험관에 넣고 나면 기포가 생기나 하루 정도 정치하여 두면 기포가 없어지게 된다. 따라서 기포가 없어진 만큼 유동 파라핀의 체적이 감소되기 때문에 다음날 추가할 필요가 있다. 유동 파라핀의 주입량은 시험관내 사면의 높이보다 1㎝정도 높게 넣는다. 이때 유동 파라핀의 양이 2㎝이상이면 혐기성 상태가 되기 때

문에 보존에 어려움이 있으므로 양을 알맞게 조절하여야 한다, 유동 파라핀을 넣은 후에는 온도가 4～6℃이고 습도가 70% 내외로 조절된 보존실에서는 1～3년간 보존할 수 있지만, 안전하게 보존하기 위해서는 2년마다 교체하여야 한다.

균주의 생존성은 균주를 저온보다는 실온에 가까이 보존할 때 높다. 그러나 온난지 특히 여름에 기온이 30℃이상으로 올라가는 실험실이라면 보다 시원하고 적절한 장소를 찾을 필요가 있다. 이상적으로는 공기 유통이 양호하고 온도가 15～20℃정도로 조절된 항온 보존실에 두는 것이 바람직하다. 풀버섯이나 목이 등의 균사체는 저온에 약하므로 이러한 저온 감수성의 균주는 유동 파라핀 중층법으로 생물활성을 억제하여도 저온에 대한 내성이 낮은 성질은 변하지 않으므로 주의를 해야 한다. 

계대 보존법과 비교하여 유동 파라핀 보존법에서 이식되는 접종원은 다소 큰 것으로 최저 2개소에 접종하는 것이 생육이 잘 되고 안전하다. 균사체 전면이 유동 파라핀에 의해 덮여 있기 때문에 새로운 배지에 접종하여도 발아 신장이 늦어지거나 때에 따라서는 발아되지 않는 경우가 있다. 이러한 것은 접종원을 멸균 증류수로 잘 세척하여 부착되어 있는 유동 파라핀을 제거한 후에 사용한다. 또는 샬레 내 배지의 한쪽에 파라핀 보존 균주에서 떼어낸 접종원을 여러 개 둔 다음 샤레를 경사지게 놓고 밑으로 파라핀이 내려오게 한 후, 접종된 균주가 배양되면 파라핀이 없는 곳의 균사체 (콜로니)에서 절편을 떼어 새로운 사면 배지에 이식하는 것이 좋다. 새로 배양한 균주도 유동 파라핀 중층법 등으로 남겨두는 것이 바람직하다.

유동 파라핀 보존법은 진균류를 보존하는 데 널리 쓰이는 간편한 장기보존 방법으로서 많은 종류의 균주를 양호하게 보존할 수 있

는 장점이 있다. 특히 균사 생장 중 포자를 형성하지 않기 때문에 동결건조법, L- 건조법(진공건조)을 사용하지 않는 사상균류나 버섯류의 보존법으로서 대단히 편리하고 유효한 보존법이다. 

(3) 냉동 보존법

배양된 균주를 그대로 동결시켜 생물활성을 정지시킨 상태로 장기간 보존하기 위한 방법이다. 계대 배양에 의해 생기기 쉬운 형질의 변이, 퇴화를 방지하며 특히 포자를 형성하지 않는 사상균류를 안전하게 장기 보존하는 최적의 방법이다. 버섯류는 품종특성, 주로 생리적~생화학적 특징을 결정하는 많은 유전정보를 그대로 반영구적으로 보존할 수 있다. 급격한 동결시에 야기되는 세포의 파괴현상을 방지하기 위해 동결 보호제로서 10％ 혹은 5% 글리세린 또는 DMSO, PEG를 사용한다.

(가) 냉동 보존법 (- 40～0℃)

오래 전부터 사용되어 온 방법으로 전기식 냉동고(- 40～- 20℃), 드라이아이스(- 40℃) 등을 사용하여 보존하는 방법이다. 동결내성이 강한 곰팡이류, 버섯류의 배양균사체 또는 자실체가 적합하다. 

크리오관(cryo- tube)을 이용한 장기 보존 균주

(나) 초저온 냉동 건조법 (- 100～- 80℃)

전기식 냉동고에서 냉동 보존하는 방법이다. 최근 다양한 종류의 초저온 냉동고가 시판되고 있는데 어떤 것은 - 135～- 130℃까지 내려간다. 일부 보존기관에서는 - 80℃의 전기식 냉동고를 써서 10% 글리세린 수용액 1㎖를 함유한 크리오관 (동결용 나사마개가 있는 작은 시험관)에 배양 균사체를 침적하여 4℃까지 예냉한 후 냉동고에 동결시켜 그대로 보존한다. 

균주수가 대단히 많기 때문에 이러한 냉동고를 써서 가장 좋은 동결조건을 검토하여 획기적으로 동결 보존하고 있으며 지금까지 5년 이상 경과된 많은 수종의 다양한 곰팡이 및 버섯류가 잘 보존되고 있다. 예를 들면 목이류, 만가닥버섯류, 깔대기버섯류, 비단털버섯속(Volvariella) 등의 균주에서는 동결보존 후 생존이 어려운 것도 있다.

(다) 액체 질소법 (- 196～- 150℃ )

액체질소 (LN2)의 기상 (- 150℃) 또는 액상 (- 196℃)에서 동결 보존하는 방법으로서 많은 미생물 배양균주, 동물세포 배양주를 장기 보존하는 데 이용되고 있다. 액체질소 이용을 위해 만든 스텐레스 스틸제의 보존용기 (탱크)에 대규모의 액체질소 자동 공급장치를 설치하여 연속적으로 액체질소를 보충한다. 액체질소 기상에 보존하는 경우, 전기식 냉동고를 쓰는 경우에서처럼 크리오관과 같은 나사관이 달린 시험관을 쓸 수 있으며, 액상 중에 보존하는 경우 유리제 앰플을 쓰지 않으면 안 된다. 기상 액상에 보존하는 경우 균주를 포함한 샘플병을 실온 조건하에서 직접 액체질소 중에 넣어서 동결시키면 소위 급속동결이 된 균주가 사멸하는 경우가 많다. 이를 방지하기 위해서 냉동고에서 서서히 분당 1℃ 정도로, 

- 40~- 30℃정도까지 예비 동결한 다음 액체질소로 옮겨 온도를 하강시켜 보존하는 것이 좋다. 사멸이 쉬운 균주의 경우, 프로그램 냉동고를 써서 모두 미리 동결조건을 설정한 다음 동결 보존한다. 설치비와 운영비가 많이 든다 (버섯학, 1997).

버섯 균사체를 활력있게 배양 증식하기 위해서는 버섯의 생리적 특성에 적합한 환경을 조성해 주어야 한다. 배지는 버섯균의 생장을 위한 영양원과 수분을 제공하므로 탄소원, 질소원, 비타민, 미량원소들과 같이 생명유지에 필요한 요소를 모두 함유해야 한다. 버섯의 균사 배양에 사용하는 배지의 종류는 크게 천연 배지와 합성 배지로 구분하며, 천연배지는 원균의 증식～보존 등에 주로 사용되고 합성 배지는 영양원 시험, 미생물 생리 실험, 영양 요구성 변이 균주의 선발 등 특수한 실험에 많이 사용된다.

(4) 보존제 종류 

보존제를 사용하는 이유는 세포내 유리수가 냉동 상태일 때 빙결되어 세포를 파괴시키므로 세포를 보호하기 위해 사용한다. 보존제의 종류는 다음과 같다. 

(가) DW Stock

① 보존온도 : 4～18℃

(나) 10% Glycerol Stock

① 제조법 : dH₂O 90㎖ + 글리세롤 (glycerol) 10㎖

② 보존온도 : 4～18℃

(다) 5% Polyethylene Glycol (PEG) Stock

①제조법: dH₂O 100㎖ + 폴리에틸렌 글리세롤 (polyethylene glycol)5g

② 보존온도 : - 70～- 196℃

(라) 10% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Stock

① 제조법 : dH2O 100㎖ + 디메틸술폭시드(DMSO) 10g

② 보존온도 : - 70～- 196℃

2. 버섯 종균의 관리

가. 우량종균의 구비조건 

우량품종은 재배적 특성이 모두 우수하여야 하는데 일반적으로 다음 조건을 구비한 것이어야 한다. 

(1) 균등성 : 품종의 형질들의 특성이 모두 균일하여야만 재배상이나 이용면에서 유리하다. 품종의 특성이 균일하기 위해서는 유전성이 균일하여야 한다. 

(2) 우수성 : 다른 품종보다도 재배적 특성이 우수하여야 한다. 모든 특성이 우수하기는 어려워도 어느 한가지라도 치명적인 결함은 없어야 한다. 

(3) 영속성 : 우수한 특성이 대대로 변하지 않고 영속적으로 유지되어야 한다. 특성이 영속되기 위해서는 유전적으로 고정되어 있어야 하며 퇴화되는 것이 방지되어야 한다. 

(4) 광지역성 : 균일하고 우수한 특성의 발현이나 적응되는 정도가 가능한한 넓은 지역에 걸쳐서 나타나야 한다. 

불량한 종균을 심으면 수량이 감소되고 품질이 좋지 못함은 물론 심하면 재배에 실패하는 경우도 생긴다. 최근에는 종균배양 기술이 많이 향상되고 시설도 개선되었지만 농가에 유통되는 종균 중 일부는 배지의 수분함량이 적고 균사생장이 극히 부진한 것이 많이 발견되고 있다. 버섯재배에 실패한 일부의 농가에서는 불량종균에 의한 피해라고 주장하는 경우도 점차 늘어나는 추세이다. 우량종균을 확보하기 위해서는 다음과 같은 유의점이 필요하다.

(5) 종균계약 : 재배시기와 목적에 알맞은 품종을 선택하여 접종 예정일 1～2개월 전에 인근 종균배양소나 시‧군 임업협동조합과 공급계약을 체결하고, 그 후 수시로 공급에 차질이 없도록 확인한다.

(6) 종균확인 : 종균을 인수 받을 때 검사필증의 품종을 확인하고, 임의로 몇 병을 뽑아서 전체적인 종균상태를 살펴본다.

(7) 종균의 저장 : 종균이 적정 배양 기간에 도달했을 때 사용하는 것이 가장 이상적이지만 여건상 부득이하게 저장해야 할 경우가 있는데, 이 때는 종균의 오염과 노화 방지를 위해 깨끗한 장소에서 저온으로 관리해 줄 필요가 있다. 변온 조건에 장기간 저장하게 되면 버섯이 발생되기 쉬우므로 정온 상태에 저장해 두는것이 중요하다. 종균의 저장 온도는 1～5℃, 중온성 5～10℃, 고온성 10～15℃에서 저장하는 것이 바람직하다. 주요 버섯별 종균의 저장 온도는 팽이버섯‧ 맛버섯 1～5℃, 양송이‧느타리버섯‧표고버섯‧잎새버섯‧만가닥버섯 5～10℃, 털목이버섯‧뽕나무버섯 10℃, 영지 10℃이다.

나. 종균검사방법

(1) 육안검사

배양이 완료된 종균에 대하여 품종 및 접종일자별로 2,000병 이상 5,000병 이하의 무작위로 추출하여 검사한다.

(가) 종균의 균일성 : 배지 전체에 백색의 균사가 완전하게 만연되어 있어야 하며, 균의 퍼짐상태가 뚜렷하고 선명해야 한다. 녹색, 청색, 황색, 갈색, 회색, 흑색 등의 잡균에 의한 반점이 없어야 하고, 특히 마개 밑부분에 잡균이 생기기 쉬우므로 면밀히 관찰해야 한다.

(나) 종균의 버섯향 : 균사는 전체적으로 만연하였으나 엷음, 흐림, 얼룩 등의 증상이 있으면 세균에 의한 오염일 가능성이 높으므로 종균의 냄새를 확인한다. 정상적인 종균은 버섯향이 나지만 세균에 오염된 종균은 쉰 듯한 술 냄새가 난다.

(다) 신선한 종균선택 : 장기간 저장된 종균은 가급적 피하고, 병속에 균 덩이가 형성되어 있거나, 노화되어 노란빛을 띠거나, 균사가 선명하지 못하고 밀가루 반죽을 바른 것과 같이 보이거나, 병 내부나 바닥에 노란물이 생긴 것 등은 장기 저장된 종균으로 간주해도 좋다.

(2) 실내검사

톱밥종균의 배지를 꺼내 손으로 가볍게 파쇄한 다음 부스러기를 들어 올렸을 때 종균 부스러기들의 연결성이 있는지를 확인한다. 연결성이 좋을수록 양질의 종균이다. 여기에 소개되는 간이검사법은 균류를 분리하는 미생학적인 한 방법이므로 조작과 취급에 있어 살균과 청정의 개념이 기본적으로 뒤따라야 한다. 그러나 조작과 취급에 최소한 주의를 기울인다면 농가단위에서 비교적 손쉽고 빠

르게 종균을 검사해 볼 수 있는 한 방법이다. 

(가) 시험관 검정법 

① 접종원 검사 : 배양이 완료된 접종원은 반드시 세균의 오염 여부를 검정한 후 사용하여야 하며, 검정방법은 시험관 배지상(PDA)에 접종원을 조금씩 떼어 넣고 25℃와 45℃에서 3～5일간 배양하여 잡균의 발생여부를 확인한다. 

② 균사활력 왕성한 것 : 접종된 시험관을 3～5일간 배양 후 45℃의 시험관 배지에서 배양한 배지에는 아무런 변화가 없고, 25℃에서 배양한 배지에서만 백색의 균사가 재 부상된 것을 사용한다.

(나) 습실배양법

① 균류가 살기 좋은 조건인 습실을 이용한 방법으로 입구가 넓고 투명한 소형 쥬스병 등을 이용하여 바닥으로부터 1/3지점에 이르는 곳까지 깨끗한 거즈나 키친타올 등으로 다져서 체운 다음 깨끗한 물을 넣어 충분히 젖도록 한 후, 그 위에 알루미늄 호일을 접시형태로 접어서 놓는다. 

② 종균을 알루미늄 호일 위에 5～10g정도 올려놓고 마개를 닫아, 직사광선이 닫지 않는 20～30℃ 되는 곳에 3～5일간 두고 균사의 재 부상 상태를 관찰한다. 

③ 양질의 종균은 균사가 뻗어나와 톱밥 종균이 새하얀 솜털로 피복된 것처럼 보이고 끄집어내어 만져보면 종균 부스러기가 균사로 연결되어 한 개의 덩이로 다시 붙어 있다. 균사가 재 부상 되지 않거나 재 부상 속도가 늦으면 종균의 활력이 낮다는 것을 의미한다. 

④ 푸른 곰팡이병에 감염된 경우 녹색, 청색, 녹황색, 청록색 등으로 나타나며, 붉은빵 곰팡이병에 감염된 경우 오렌지색, 분홍색 등으로 

나타나며, 검은털 곰팡이병이나 흑회색 융단곰팡이 병에 감염된 경우 검은색～흑회색 등으로 나타난다. 이러한 진균에 감염된 종균은 포자가 형성되어 각각의 특징적인 색깔을 나타내며, 세균에 감염된 종균은 균사가 전혀 재부상 되지 않고 끈끈한 점액질이 형성된다.

(다) 멸균수 배양법 

① 종균을 멸균수에 넣어 배양하는 방법으로서 250㎖ 삼각프라스크나 쥬스병 등에 100㎖ 정도의 증류수를 넣고 마개를 닫은 다음, 121℃에서 15～20분간 고압증기 살균을 한다. 

② 살균이 끝나면 25℃ 정도로 식혀, 크린벤취 안에서 화염 살균한 스푼으로 톱밥 종균을 5～10g 정도 떠 넣고, 25～30℃의 항온기에서 3～5일간 배양을 한다. 

③ 잡균에 오염되지 않은 건전한 종균은 물의 색깔이 맑고 수면에 하얀색의 균사가 떠 자라지만, 진균병에 감염된 종균의 경우 물의 색깔은 맑고 투명하나 수면에 특징적인 색깔을 나타내며 병원균의 균사와 포자가 떠서 자란다. 또한 물의 색이 흐리고 투명하지 못하며 마치 고름이 물에 현탁되어 있는 듯한 느낌을 주고 수면에도 끈적한 점액질의 막이 형성되는 것은 세균에 감염된 종균이다. 

다. 종균진단 요령

(1) 종균의 배양과정 중 잡균이 발생하는 원인 :

살균이 잘못되었을 때

오염된 접종원의 사용

접종 중 무균실에서의 오염

배양중 솜마개로부터 오염

배양실의 온도변화가 심할 때

배양실 및 무균실의 습도가 높을 때

(2) 유리수분의 생성원인 :

곡립배지의 수분함량이 높을 때

배양기간 중 변온이 심할 때

에어콘 또는 외부의 찬 공기가 유입될 때 

장기간의 고온저장

배양 후 저장실로 바로 옮길 때 

(3) 균사발육 부진 원인 :

살균한 곡립배지의 온도가 높을 때 접종

퇴화된 접종원의 사용

배양실의 적온유지가 안될 때 

곡립배지의 수분함량이 극히 적을 때 

곡립배지의 산도가 너무 낮거나 높을 때

세균에 오염되었을 때

라. 종균의 저장 및 관리

배양이 완료된 종균은 즉시 심는 것이 활력이 왕성하므로 가장 좋으나 농가의 종균재식 준비가 불충분하거나 대량으로 배양할 경우에는 저장을 해야 한다. 저장온도는 0～5℃의 저온으로 어두운 곳에 하되 온도는 단계적으로 서서히 하강시키며 저장 중에도 수시로 흔들어 준다. 종균은 저장 중 온도가 높고 기간이 길수록 균사가 노화되기 쉬우며 활력이 떨어지고 수량이 감소되므로 단기간의 저장이라도 반드시 냉암소에 보관하는 것이 필수적 조건이다. 

헝가리 실반의 곡립종균 배양실

프랑스 아미셀 배양실의 양송이     곡립종균(배양이 거의 완료된 상태)

3. 종균의 퇴화 방지 

가. 종균의 퇴화원인

종균의 퇴화는 버섯균의 생리적인 요인, 환경적, 인위적 요인에 의해 필연적으로 기인하며, 그 원인은 다음과 같다.

(1) 유전적인 변이

모든 생물은 번식과 생장과정에서 변이가 생기게 되고 이로 인하여 유전적인 변이가 생기게 되고 유전적으로 고정된다. 하나의 종균으로 사용기간이 길면 길수록 유전적인 변이가 생기게 된다.

(2) 장기적인 보관 

장기간 보관 할수록 생존에 필요한 에너지라든지 대사에 관여하는 영양분의 소모가 일어나고 유기산의 발생과 축적에 인한 산도의 변화 등에 의하여 세포기관의 발육이 제대로 이루어 지지 않아 생리작용과 효소합성의 저해로 대사 작용의 평형을 잃게 되어 균이 퇴화 된다. 

인공적으로 합성한 배지에서는 균은 생존하지만 버섯은 잘 형성하지 못한다. 이렇게 오래 보존되면 배지를 분해하는 능력이 떨어지고 종균의 활력도 떨어진다고 볼 수 있다.

(3) 불량환경

고온, 다습, C/N 율의 차이, 산도 등에 의한 변이의 가능성이 생기고 이로 인한 퇴화도 생기게 된다.

(4) 종균 배양자의 지식

균에 대한 전문적인 지식이 없는 사람이 원균의 관리나 증식 등의 작업을 통해 변이의 폭을 넓힐 수 있다.

나. 종균의 퇴화방지

가장 좋은 방법은 본래의 원균을 잘 보존하고, 좋은 배지에 적당한 조건으로 보존하는 것이 가장 중요하다. 그리고 균이 퇴화 되었다면 모균주와 가장 비슷한 버섯 자실체를 채취하여 조직분리나 포자분리에 의한 교잡 등으로 특성을 유지 하여야 한다. 

(1) 균총의 형태적, 균락 형태와 자실체 형태 등을 엄밀히 관찰하

고, 버섯 의 생리적 형태적 특성을 세밀히 관찰하여야 한다. 

(2) 원균배양과 계대배양은 전문가가 하여야 하며, 종균의 제조에도 해박 한 지식을 소유하여야 하며 종균의 감정과 감별에도 경험이 풍부한 사람이 하여야 한다. 

(3) 계획적으로 유성과 무성번식을 교차하게 하여야 하며, 조직분리 등을 통한 우량한 균주의 선발이 중요하다. 그리고 계대배양 과정에서 이상한 점이 발견되면 바로 폐기하고 원균에서 다시 증식하도록 하여 야 한다. 

(4) 한 가지 배지만 사용하다 보면 영양분과 미량원소 등이 제한되어 있어 균체의 활력이 떨어지고 종균이 퇴화하게 된다. 따라서 제때에 배지를 바꾸어 균의 활력을 증진시켜야 한다. 

(5) 적합한 종균의 보존시설을 갖추는 것도 중요하다. 

다. 우량종균 생산을 위한 제안

한 연구기관이 종균 업체를 대상으로 조사한 결과에 의하면 조사 대상의 30% 가까이가 잡균에 오염되는 등 종균의 생산과 관리에 큰 허점이 드러난 상태이다. 이러한 상황과 더불어 최근 병해충의 증가로 실패 농가는 증가하고 있으며, 재배자의 종균에 대한 불신은 더욱 늘어나고 있는 실정이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 몇 가지 방안을 제안한다. 

첫째 종균으로 인해 농가가 피해를 입지 않기 위해서는 농가 스스로가 먼저 의식을 바꾸어야 한다. 우선 계약에 의한 종균거래 관행을 농가 스스로가 깨지는 않았는지? 주문을 하고도 누가 더 싸게 종균을 공급한다면 먼저 주문한 것은 없던 일로 해버리지는 않았는지? 또 농가 스스로가 누가 어떤 종균으로 농사를 지어 돈을 벌었다면 무조건 종균 업체에 그 종균을 내놓으라는 식으로 하지

는 않았는지? 또한 종균을 거래할 때는 거래명세서를 꼭 주고받고, 종균 인수 시 품질 표시 란의 품종명은 제대로 기재되어 있는지 등을 꼼꼼히 살펴보아야 한다. 특히 최소한 재배하기 1～2개월 전 배양소를 방문하여 품종 및 수량을 계약하여 종균에 이상이 없는 한 꼭 지켜 상호간의 신뢰를 쌓아야한다. 

둘째  전국의 종균 배양소는 60여개로 난립되어 있어 유통질서가 문란하고, 생산비 상승 및 시설의 낙후로 품질을 등하시하기도하며 덤핑, 노화종균, 타사종균 끼워 팔기 등의 문제도 없지 않아 이러한 점은 배양소 측에서 개선되도록 노력해야한다.

셋째  현재의 종균 배양소 시설 및 인력으로는 우량종균 생산이 어려우므로 시설 현대화와 더불어 우량종균을 생산하기 위한 접종원 공급센터 건립으로 농민들이 안심하고 사용할 수 있는 우량종균 배양업체를 많이 육성하여 국내버섯 수요에 대처하고 나아가 수출산업이 될 수 있도록 정부는 적극 지원해야한다.